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谷胱甘肽的檢測手段
  • 釋出日期╃·:2023-01-11      瀏覽次數╃·:119
    • 谷胱甘肽檢測方法較多₪☁↟₪·,比較常用的有碘量法₪•↟₪、DTNBEllman試劑)₪•↟₪、亞硝基鐵氰化鈉法₪•↟₪、熒光法₪•↟₪、四氧嘧啶法高效液相色譜法 HPLC)│☁。上述方法各有優點₪☁↟₪·,在檢測GSH含量時可根據實際情況₪☁↟₪·,選擇適合₪•↟₪、靈敏₪•↟₪、精確的檢測方法│☁。

      DTNB比色法

      原理╃·:DTNB與谷胱甘肽的巰基反應生成黃色的5 - 硫代 - 2 - 硝基苯甲酸₪☁↟₪·,在412 nm波長處有最大吸收峰₪☁↟₪·,而DTNB在400nm以上幾乎沒有吸收峰│☁。向含有谷胱甘肽的試樣中加入少量的DTNB₪☁↟₪·,將反應液在412 nm處測定吸收值₪☁↟₪·,根據吸收值的大小即可求得谷胱甘肽含量│☁。

      方法步驟╃·:

      1₪•↟₪、DTNB貯存液配製╃·:將0.01 mol/L的DTNB溶解於0.05 mol/L的磷酸緩衝液(pH7.0)中形成DTNB貯存液│☁。

      2₪•↟₪、DTNB分析液配製╃·:將DTNB貯存液用0.5 mol/L₪•↟₪、pH8.0的Tris - HCl緩衝液稀釋100倍₪☁↟₪·,配成DTNB分析液₪☁↟₪·,避光放置₪☁↟₪·,現配現用│☁。

      3₪•↟₪、操作步驟╃·:取谷胱甘肽標準品溶液或待測樣品溶液(0.1 ~ 3.0 mol/L)0.5 mL₪☁↟₪·,加入到1.5 mL濃度為0.15 mol/L的NaOH溶液中₪☁↟₪·,再加入3%的甲醛溶液05mL₪☁↟₪·,在pH8.0₪•↟₪、25℃下反應2 min₪☁↟₪·,反應結束後₪☁↟₪·,取反應液0.5 mL加入DTNB分析液₪☁↟₪·,在25℃下反應5 min₪☁↟₪·,于波長412 nm下測定吸收值│☁。根據兩者的吸光度₪☁↟₪·,計算差值₪☁↟₪·,代入標準曲線₪☁↟₪·,計算出谷胱甘肽的含量│☁。

      碘量分析法

      原理╃·:利用谷胱甘肽的還原性與碘酸鉀進行反應₪☁↟₪·,當谷胱甘肽wanquan反應時₪☁↟₪·,碘酸鉀將碘化鉀氧化為碘₪☁↟₪·,碘使澱粉指示劑變成藍色₪☁↟₪·,即為滴定終點│☁。

      操作步驟╃·:精確稱取谷胱甘肽樣品0.05 mg₪☁↟₪·,放入10 mL燒杯₪☁↟₪·,用2%的HPO3溶解₪☁↟₪·,移入100 mL容量瓶₪☁↟₪·,用水定容至100 mL│☁。吸取上述溶液5 mL放入100 mL 三角瓶內₪☁↟₪·,再加入2% HPO35 mL使之成為10 mL₪☁↟₪·,然後向其中加入5%碘化鉀1 mL及澱粉指示劑2滴│☁。採用0.001 mol/L的碘酸鉀滴定₪☁↟₪·,以消耗0.001 mol/L碘酸鉀的數值與理論值2.445 mL一致時₪☁↟₪·,則成品中谷胱甘肽含量為100%│☁。

      計算公式中₪☁↟₪·,V-消耗0.001 mol/L碘酸鉀的體積(mL)₪☁↟₪·,2.445 -100%含量應消耗的體積(mL)│☁。

      高效液相色譜法

      原理╃·:高效液相色譜法是由於溶質在同定相和流動相之間的分配係數₪•↟₪、親和力₪•↟₪、分子大小₪•↟₪、吸附能力等不同₪☁↟₪·,而進行連續分離的過程│☁。

      操作步驟╃·:

      ①色譜條件

      色譜柱╃·:Kromasil C18柱(4.6 mm × 250 mm₪☁↟₪·,5 μm)│☁。

      流動相╃·:磷酸二氫鈉和辛烷磺酸鈉混合溶液(磷酸二氫鈉3.0 g₪•↟₪、辛烷磺酸鈉1.0 g₪☁↟₪·,加水溶解並定容至500 mL₪☁↟₪·,用磷酸調溶液pH為3)╃·:乙腈 = 96╃·:4(體積比)│☁。

      檢測波長╃·:210 nm₪☁↟₪·,流速0.8 mL/min₪☁↟₪·,柱溫30℃₪☁↟₪·,進樣量10UL│☁。

      ②製作標準溶液

      準確稱取谷胱甘肽標準品適量₪☁↟₪·,用去離子水溶解於容量瓶中₪☁↟₪·,混合均勻₪☁↟₪·,定容₪☁↟₪·,製成25 μg/mL₪•↟₪、50 μg/mL₪•↟₪、100 Vg/mL₪•↟₪、200 μg/mL₪•↟₪、400 μg/mL₪•↟₪、800 μg/mL系列濃度樣品液₪☁↟₪·,作為標準溶液│☁。

      ③樣品製備

      準確稱取谷胱甘肽樣品₪☁↟₪·,加去離子水₪☁↟₪·,混合均勻₪☁↟₪·,製成濃度為25 ~ 800 μg/mL的樣品溶液₪☁↟₪·,作為分析溶液│☁。

      ④繪製標準曲線

      將配置的谷胱甘肽標準液₪☁↟₪·,分別吸取10 μL進樣測定₪☁↟₪·,以谷胱甘肽谷胱甘肽生產技術濃度和峰面積繪製其標準曲線₪☁↟₪·,根據標準曲線得出該曲線的迴歸方程│☁。峰面積的變化應與谷胱甘肽的質量濃度呈線性關係₪☁↟₪·,其擬合度應達0.9995以上│☁。

      ⑤樣品的測定

      取谷胱甘肽樣品分析液10 μL₪☁↟₪·,用高效液相色譜儀進樣測定₪☁↟₪·,得到樣品溶液的峰面積₪☁↟₪·,根據迴歸方程計算出谷胱甘肽的含量│☁。


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